دستگاه اسپکتروفتومتری، دستگاهی است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می‌کند. اساس کار این دستگاه که با تابش الکترومغناطیسی باعث جذب مواد شده و از روی شدت جذب هر ماده، مقدار ماده یا همان غلظت ماده تعیین خواهد شد. این دستگاه در تجزیه و تحلیل عنصرهای مولکولی همانند DNA و RNA نیز کاربرد دارد و کاربرد اصلی آن در بیوشیمی است. این دستگاه امکان اندازه‌گیری غلظت فوق‌العاده ای کوچک را نیز می‌تواند اندازه‌گیری را دارد.
اساس کار دستگاه اسپکتروفتومتر یا طیف سنج اینست که با عبور نور از یک آنالیت و تعیین میزان جذب و عبور نور از آن به تعیین خصوصیات آن آنالیت و ماده شیمیایی می‌پردازد. نور مورد استفاده طیفی از انرژی الکترومغناطیس می‌باشد که هر طیف نوری دارای طول موج و فرکانس مشخصی است.
اجزای دستگاه اسپکتروفتومتر
- منبع نور یا لامپ اسپکتروفتومتر
نقش منبع نور در دستگاه اسپکتروفتومتر تولید انرژی تشعشعی است. لامپ‌های تنگستنی محدوده طول موج گسترده‌ای را به صورت ممتد از خود منتشر می‌نماید که این طول موج‌ها برای اندازه‌گیری در مناطق مختلف الکترومغناطیس و بخصوص در منطقه مرئی و فرابنفش استفاده می‌شود.
- سیستم کنترل ولتاژ
در این روش طیف سنجی باید شدت نور خروجی از لامپ ثابت باشد. چنانچه ولتاژ برق ورودی تغییر به دستگاه تغییر کند. شدت نور لامپ نوسان پیدا می‌کند و باید تنظیم کننده ولتاژ دز دستگاه باشد.
- مونوکروماتور
این بخش دستگاه طیف سنج، نور تولیدی توسط لامپ را به پرتوهای تک رنگ تبدیل می‌نماید. این فیلترهای مونوکروماتور شیشه‌های رنگی هستند که بخش زیادی از پرتوها را جذب کرده و فقط طول موج‌های محدودی را از خود عبور خواهد داد.
- سیستم گریتینگ
این سیستم در مونوکروماتور طیفی موازی یا خطی تولید می‌کند. این سیستم از صفحه ای صیقل داده شده با شکاف‌هایی موازی در فاصله‌هایی نزدیک به یکدیگر ساخته شده اند. با فرود نور به سیستم grating، طیف‌های بسیار ضعیفی به ازاء هر یک از خطوط سیستم grating تشکیل می‌شود.
آشکار ساز
برای اندازه گیری شدت جریان الکتریکی و تبدیل انرژی نوری به الکتریکی از این دستگاه استفاده می‌شود.
- وسیله نمایشگر
در اسپکتروفتومترها نمایشگر می‌تواند علامت خروجی از اسپکتروفتومتر را به صورت های مختلف نشان داد. برای نمایش این علامت استفاده کامپبوتر از نرم افزار برای آنالیز داده ها می‌باشد.
- جایگاه نمونه
برای قرار دادن نمونه در محل آزمایشگاه می‌باشد. سلول ها یا کووت‌های مختلفی برای قرار دادن انواع اسپکتروفتومتر استفاده می‌شود.
در دستگاههای جدیدتر اسپکتروفتومتری یک برد میکروپروسسوری به همراه یک نرم افزار طراحی شده وظیفه کنترل و ایجاد ارتباط برای قسمت‌های مختلف سیستم، پردازش سیگنال و محاسبات و به طور کلی خودکار کردن برخی از فعالیت‌های سیستم را بر عهده دارد.
انواع دستگاه اسپکتروفتومتر
انواع دستگاه اسپکتروفتومتر از نظر بازه طول موجی
اسپکتروفتومتر را از نظر طول موج و زمینه کاربرد به 5 دسته متفاوت تقسیم می‌کنیم:
1.اسپکتروفتومتر VIS (مرئی)
2.اسپکتروفتومتر UV-VIS (مرئی-فرابنفش)
3.اسپکتروفتومترIR (مادون قرمز)
4.اسپکتروفتومتر DRS (Deffuse Reflectnce Spectroscopy)
کاربرد دستگاه اسپکتروفتومتر
کار دستگاه اسپکتروفتومتر برای اندازه‌گیری کیفی و کمی انواع مواد معدنی، آلی و یون‌های فلزی بکار می‌رود. اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های مختلف، کلسترول، تری گلیسیرید، قند، لیپوپروتئین ها، اوره، کراتین و ترکیبات مشابه، انواع داروها و همه یون‌های فلزی با اسپکتوفتومتری امکان‌پذیر است.
همچنین این دستگاه قابلیت اندازه‌گیری نمونه‌های فوق العاده کوچک را داشته و لذا از آن برای تجزیه عناصر مولکول‌های RNA استفاده می‌شود. لذا از دستگاه اسپکتوفتومتر در زمینه‌های مختلف از جمله تجزیه مواد در رشته‌های شیمی، مواد، کشاورزی، شیمی کاربرد دارد.
ساختار یا پیکربندی دستگاه اسپکتروفتومتر
دستگاه اسپکتروفتومتر با دو پیکربندی یا ساختار تک پرتویی یا سینگل بیم (Single Beam) و دو پرتویی یا دبل بیم (ِDouble Beam) ساخته می‌شوند.
دستگاههای تک پرتویی طوری طراحی شده که تمام نور از محل نمونه آن عبور می‌کند و جذب محلول نمونه با جذب نمونه بلانک یا شاهد مقایسه می‌شود. با این اسپکتروفتومترها را در طول موج بیشینه آن می‌توان اندازه‌گیری نمود. ابتدا با استفاده از سلول یا کووت حاوی حلال، مقدار عبور (Transmittance) روی 100% و یا میزان جذب (Absorbance) روی صفر تنظیم شده، سپس آن با سلول حاوی نمونه جایگزین می‌شود. در نهایت میزان عبور یا جذب نمونه (آنالیت) ثبت می‌شود.
در دستگاههای دو پرتویی، نور مونوکروماتور به دو باریکه با استفاده از آینه ها، مانند یک آینه چرخان و یک آینه نیمه شفاف تقسیم می‌شود. یکی از این پرتوها از درون محلول شاهد یا بلانک و دیگری از درون محلول نمونه عبور می‌کند. در سیستم دو پرتویی عمل حذف جذب شاهد به صورت اتوماتیک بوده است و عمل مقایسه بین شاهد و نمونه هر چند ثانیه چندین بار انجام می‌شود. اسپکتروفتومتر دو پرتویی نسبت به اسپکتروفتومتر تک پرتویی دو مزیت مهم دارند که عبارتند از: کنترل و سنجش سریع نمونه و شاهد سبب حذف خطاهای ناشی از نوسان‌های شدت منبع، ناپایداری الکترونی و هر گونه تغییر دیگر در سیستم نوری می‌شود. مزیت دوم اینست که عملیات طیف گیری و ثبت کل طیف تماما به صورت اتوماتیک انجام می‌شود.
تنظیم دستگاه اسپکتروفتومتر
در ابتدا باید مواد مزاحم را از محلول مورد نظر دور کرد تا در نتیجه آزمایش تاثیر نگذاشته باشد. برای تعیین مقدار یک ماده باید حتی المقدور مواد مزاحم را باید دور کرد تا از پیدایش مواد بیگانه در آن جلوگیری کنیم. برای این منظور در اغلب اندازه‌گیری ها به کمک ترکیبات مختلف، پروتئین های خون یا پلاسما را رسوب داده و آزمایش را بر روی محلول صاف انجام می‌دهیم.
طول موج‌های مختلف، رنگ‌های مختلفی را تولید می‌کند و در دستگاه اسپکتوروفتومتری طول موج بر اساس رنگ محلول رنگی صورت می‌گیرد. یعنی باید طول موجی را در نظر بگیرید که رنگ آن مکمل رنگ محلول رنگی باشد. مثلا اگر یک محلول رنگی داشته باشیم و نوری از آن عبور دهیم، مقداری از این نور جذب می‌شود که این نور جذب شده دارای رنگ محلول رنگی می‌باشد. که این مقدار بستگی به غلظت محلول رنگی دارد. لذا دستگاه اسپکتروفتومتر توسط فیلتر، منشور و … نور تک رنگ تولید می‌کند تا بتوان غلظت یک محلول رنگی را محاسبه کرد. محلول های رنگی در رنگ مکمل خود حداکثر جذب نور را دارند که شدت و ضعف این رنگ بستگی به مقدار ماده موجود در محلول مواد را دارد.
در هنگام کار با دستگاه اسپکتروفتومتر باید نکات زیر را رعایت کنیم
- دستگاه اسپکتوروفتومتر باید بر روی سکوی صاف بدون شیب و بالاتر از سطح زمین قرار گیرد.
- دستگاه اسپکتوروفتومتر را نباید در نزدیکی دستگاه هایی که امواج الکترومغناطیسی یا امواج الکتریکی شدید تولید می‌کنند، قرار داد.
- در هنگام راه اندازی دستگاه اسپکتوروفتومتر و وصل آن به برق باید از ups یا ثابت کننده جریان و محافظ برق استفاده نمود.
- بعد از روشن شدن دستگاه، حداقل زمان لازم برای پایداری دستگاه 15 دقیقه می‌باشد. پس از این مدت دستگاه گرم شده و به پایداری حرارتی و الکترونیکی می‌رسد و برای استفاده آماده می‌باشد.
- از ریختن نمونه در داخل سل هولدر و روی دستگاه خودداری کنید. همچنین پس از استفاده از دستگاه، باید دستگاه و سل‌های مربوطه را تمیز کرده و روی دستگاه را کاور کنید.
قبل از روشن نمودن دستگاه موارد زیر را رعایت فرمایید
- جریان برق شهری در سیستم برقرار باشد.
- سل کوارتزی دستگاه عاری از هر گونه آلودگی باشد.
- دوشاخه برق را به پریز وصل کنید.
- دستگاه power دستگاه در حالت on قرار دهید.
- یک دقیقه صبر کنید تا دستگاه در حالت Run قرار گیرد.
- پارامترهای طول موج، جذب، غلظت و … بر روی صفحه نمایشگر دستگاه نمایان می‌شود.
- اولین پارامتر که بر روی دستگاه نشان داده می‌شود طول موج می‌باشد.
- با 4 دکمه پایین صفحه نمایشگر می‌توان عدد طول موج را به دلخواه تنطیم کرد.
- بعد از وارد کردن عدد مورد نظر کلید Enter را فشار دهید تا تغییرات بر روی دستگاه اعمال شود.
- دومین پارامتر، جذب Abs می‌باشد. به منظور تنظیم دستگاه، هنگامیکه نمونه ای در دستگاه قرار ندارد دکمه Zero را فشار دهید تا دستگاه عدد صفر را نشان دهد.
- سومین پارامتر غلظت cons است. در مواردی که جهت کالیبره کردن دستگاه از فاکتور cons استفاده شود. این پارامتر کاربرد خواهد داشت.
نحوه اجرا قرائت نمونه
- طول موج نمونه را در دستگاه اعمال کنید.
- از تمیز و سالم بودن دستگاه اسپکتروفتومتر اطمینان حاصل کنید.
- مطابق با روش کار، دستگاه را با Blank صفر کنید
- نمونه را در سل ریخته، اطراف سل را تمیز کنید و سل را در مسیر پرتو نور قرار دهید.
- در مورد نمونه هایی که غلظت مشخص دارند، ترتیب نمونه‌ها از غلظت کم به غلظت زیاد رعایت شود.
- جذب هر نمونه را یادداشت کنید.
- در فواصل بین نمونه‌ها، سل را با آب مقطر شستشو دهید.
- در فواصل بین نمونه‌ها، نمونه Blank در مسیر نور قرار دهید و جذب صفر را کنترل کنید.
- در پایان کار سل دستگاه را چندین بار شستشو دهید و در محفظه مخصوص خود قرار دهید.
- دکمه power دستگاه را در حالت off قرار دهید.
- دو شاخه پریز را از برق خارج کنید.
همه چیز درباره دستگاه اسپکتروفتومتر
کار با دستگاه اسپکتروفتومتر دارای مزایا و معایبی می‌باشد. مزایای دستگاه اسپکتروفتومتر سادگی، کوچکی و ارزان بوئن آن می‌باشد، برای کاربردهای عمومی بسیار مقرون به صرفه و کار آمد می‌باشد و تعداد اجزای نوری کمتری برای انتقال نور به کار رفته است که سبب کاهش نویز شده است. معایب دستگاه اسپکتروفتومتر این است که مرجع و نمونه همیشه در یک زمان قرار نمی‌گیرند. این سبب می‌شود تا زمان طیف گیری کمی افزایش یابد.
